Le modificazioni ed i tempi di produzione
Roche Diagnostics suggerisce l'impiego di sonde marcate unicamentecon 5'-LightCycler® Red e 3'-Fluoresceina. La sintesi di 3'-LightCycler® Red 640 e 5'-Fluoresceina è possibile ma porta a risultati non soddisfacenti a causa della diversa geometria che influenza l'energia di trasferimento (FRET).
Per il genotyping, è indifferente l'uso del LightCycler® Red o della Fluoresceina: la funzione della sonda "sensore" è unicamente dipendente dalla sua inferiore temperatura di melting e dalla posizione che interessa le posizioni variabili.
5'-LightCycler® Red 640 |
La produzione prevede la coniugazione di LC Red 640-amminoesil
(spacer) –5'-OH con un oligo marcato con gruppo amminico (-NH2) a
5'. |
5'-LightCycler® Red 705 |
Questo fluoroforo viene introdotto come una normale fosforammidite
ad un oligo che viene successivamente marcato a 3' con un gruppo
fosfato. |
3'-Fluorescein (3FITC, 3FL) |
La fluoresceina deve contenere un legame sulfonilico come risultato del legame con FITC. La compensazione del colore con lo strumento LightCycler® viene calibrata su questo derivato della fluoresceina. La sintesi avviene su un supporto CPG modificato con fluoresceina. La purificazione avviene mediante cromatografia a scambio anionico, seguono gel filtrazione e dosaggio spettrofotometrico.
La consegna avviene entro 3 giorni.
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Internal LightCycler® Red 640 |
Per le applicazioni che richiedono una marcatura interna o al 3',
LC640 può essere introdotto in corrispondenza di una dT in
qualsiasi posizione. Il prodotto è purificato su HPLC e
quantificato spettrofotometricamente. |
Controllo di Qualità |
Le sonde di ibridazione sviluppate e/o prodotte dal "Design Service" di TIB Molbiol sono controllate dal punto di vista funzionale impiegando un protocollo standard per LightCycler®. |