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Le modificazioni ed i tempi di produzione

Roche Diagnostics suggerisce l'impiego di sonde marcate unicamentecon 5'-LightCycler® Red e 3'-Fluoresceina. La sintesi di 3'-LightCycler® Red 640 e 5'-Fluoresceina è possibile ma porta a risultati non soddisfacenti a causa della diversa geometria che influenza l'energia di trasferimento (FRET).

Per il genotyping, è indifferente l'uso del LightCycler® Red o della Fluoresceina: la funzione della sonda "sensore" è unicamente dipendente dalla sua inferiore temperatura di melting e dalla posizione che interessa le posizioni variabili.

5'-LightCycler® Red 640	La produzione prevede la coniugazione di LC Red 640-amminoesil (spacer) –5'-OH con un oligo marcato con gruppo amminico (-NH2) a 5'. Seguono la marcatura a 3' con un gruppo fosfato, la purificazione con HPLC, la gel filtrazione, la quantificazione spettrofotometrica a 260 nm. La consegna avviene entro 3 giorni (3 nmol).
5'-LightCycler® Red 705	Questo fluoroforo viene introdotto come una normale fosforammidite ad un oligo che viene successivamente marcato a 3' con un gruppo fosfato. Il prodotto è purificato su HPLC, Gel filtrazione e quantificato spettrofotometricamente. La consegna avviene entro 3 giorni.
3'-Fluorescein (3FITC, 3FL)	La fluoresceina deve contenere un legame sulfonilico come risultato del legame con FITC. La compensazione del colore con lo strumento LightCycler® viene calibrata su questo derivato della fluoresceina. La sintesi avviene su un supporto CPG modificato con fluoresceina. La purificazione avviene mediante cromatografia a scambio anionico, seguono gel filtrazione e dosaggio spettrofotometrico. La consegna avviene entro 3 giorni.
Internal LightCycler® Red 640	Per le applicazioni che richiedono una marcatura interna o al 3', LC640 può essere introdotto in corrispondenza di una dT in qualsiasi posizione. Il prodotto è purificato su HPLC e quantificato spettrofotometricamente. La consegna avviene entro 4 giorni.
Controllo di Qualità	Le sonde di ibridazione sviluppate e/o prodotte dal "Design Service" di TIB Molbiol sono controllate dal punto di vista funzionale impiegando un protocollo standard per LightCycler®.