Formati

La fluorescenza

Il rivelamento basato sulla fluorescenza è largamente diffuso nelle scienze biologiche: In molti campi ha sostituito la marcatura radioattiva. Fluorofori hanno un vantaggio "ambientale", sono più stabili, non destano preoccupazione nell’uso e, non ultimo, creano costi inferiori per il loro smaltimento.

Il rivelamento fluorescente viene usato nella microscopia a fluorescenza e nella citometria a flusso (FACS) per la marcatura di anticorpi e il rivelamento immunochimico già da tempo. Nel laboratorio di biologia molecolare ha fatto ingresso con nuove tecniche di sequenziamento all’inizio degli anni novanta. Con la disponibilità delle relative apparecchiature, in particolare del sistema SDS 7700 della Perkin Elmer e del nuovo LightCycler® della Roche Diagnostics, i sistemi a tempo reale basati sulla fluorescenza hanno aperto possibilità completamente nuove alla reazione a catena della polimerasi (PCR).

Il rilevamento a fluorescenza non è più sensibile della marcatura immunologica e tanto meno di quella radioattiva. Nella maggior parte dei casi risulta invece da 10 a 1000 volte meno sensibile di una marcatura radioattiva.

Dove sta quindi il grande vantaggio della fluorescenza?

Ci sono due aspetti centrali: da una parte esiste la possibilità di misurazioni in parallelo impiegando fluorofori a colori diversi e dall’altra parte esiste la possibilità di una misurazione continuativa nel tempo. La fluorescenza può essere osservata nel tubo di reazione chiuso (Closet Tube Format). Con le sonde appropriate è inoltre possibile la tipizzazione genica delle sonde durante la stessa amplificazione. La sensibilità assoluta non è quindi il fattore determinante per la scelta di queste tecnologie di rivelamento, considerando anche che si lavora in genere con metodi i amplificazione di acidi nucleici, prevalentemente con la PCR.

Misurazioni in parallelo:

Il termine "fluorescenza" determina la caratteristica di alcuni cromofori di emettere luce a onde più lunghe, ossia spostato verso il rosso, della luce dalla quale vengono eccitati. L’efficacia del processo viene descritto con la resa quantistica Q, un numero tra 0 e 1. Questo fenomeno è noto per fluorofori nei margini di lunghezza d’onda dall’ultravioletto (UV) al visibile (VIS) fino all’infrarosso (IR) oppure, espresso in lunghezze d’onda, da circa 300 a 800 nm. I massimi di assorbimento e di emissione sono sfasati di 15-40 nm (shift di Stokes).

Un buon fluoroforo è quindi caratterizzato da un forte assorbimento (un coefficiente elevato di estinzione), da un’alta resa quantistica (Q>0,7) e da un grande shift di Stokes. Allo stesso tempo, la sorgente di luce deve essere scelta in corrispondenza ossia vicino al massimo di assorbimento. Dato che la luce emessa ha una certa larghezza di banda i fluorofori devono avere una distanza di 15-50nm per poter essere rivelati contemporaneamente. I massimi di assorbimento vengono sfasati in modo parallelo e di conseguenza. I fluorofori non devono essere troppo distanti tra loro nel caso di una sorgente di luce monocromatica come il LASER. In pratica questo significa che in dipendenza dell’apparecchio si possono rivelare da due a quattro fluorofori contemporaneamente. Si prevede che in futuro sarà possibile sfruttare anche la diversa stabilità della fluorescenza di fluorofori diversi per l’analisi di sonde multiple.

Rivelamento nel tempo:

Fluorofori sono sensibili al loro ambiente: molecole nella loro vicinanza, in particolare altri cromofori possono offuscarli ("quench"), ossia ridurre la loro fluorescenza o addirittura estinguerla. E’ anche possibile che fluorofori vicini trasferiscano la loro energia, un fenomeno chiamato trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET). Sfruttando queste caratteristiche è possibile disegnare sensori molecolari che possono dare informazioni circa la presenza o la configurazione di molecole. Questo a sua volta permette l’osservazione continuativa di una reazione senza che uno dei partner del legame debba essere eliminato o separato come occorre nei saggi classici che si basano sui legami. Esempi per questi metodi "classici" sono i Northern e Southern blot, tecniche di blot inversi, il legame di prodotti di PCR a piastre "microtiter" e a membrane, "arrays" di cDNA o "DNA-Chips" nonché il loro rivelamento mediante sonde radioattive o apteni e anticorpi coniugati da enzimi come ad esempio il sistema della digoxigenina.

La PCR quantitativa:

L’analisi in continuazione dell’amplificazione di acidi nucleici apre delle possibilità del tutto nuove nella quantificazione degli acidi nucleici. La quantità degli acidi nucleici bersaglio è di rilevanza per problemi diversi: Nella virologia si determina il titolo dei virus, ad esempio per monitorare il successo della terapia antivirale. Nel caso delle malattie leucemiche si documentano sia il successo della terapia sia eventuali recidive in modo precoce (Minimal Residual Disease, MRD).
In seguito a trapianti di midollo osseo si può documentare l’amplificazione delle cellule provenienti dal donatore. Negli alimenti si possono quantificare le componenti, per analizzare ad esempio il contenuto di ingredienti geneticamente modificati.
Finora l’analisi di PCR quantitativa si limitava alla mera stima delle quantità di amplificato nel gel di elettroforesi o si eseguivano saggi multipli in presenza di un competitore per titolare il bersaglio dalla quantità nota di competitore. La determinazione continuativa della quantità di amplificato mediante la fluorescenza permette una misurazione della quantità di templato molto più semplice. Il numero dei cicli di PCR necessari al raggiungimento di una quantità di prodotto predeterminata è proporzionale alla quantità di materiale di partenza per una gamma ampia. Si riportano regolarmente gamme che vanno da quattro a sette ordini di grandezza. I dati vengono raccolti durante la PCR stessa; i risultati vengono ottenuti al più tardi alla fine della reazione senza ulteriori passaggi, senza il rischio di contaminazione da prodotti della stessa amplificazione e senza elettroforesi su gel.

I formati della PCR in tempo reale

Ci sono varie possibilità di generare segnali fluorescenti dipendenti dalla reazione. La più semplice è l’uso di un fluoroforo che emette fluorescenza dopo essersi legato a DNA a doppio filamento (bromuro di etidio, SYBR Green§). Tuttavia, questo segnale non è veramente specifico in quanto tali fluorofori rivelano anche dimeri formati dai primer e amplificati aspecifici.

Esistono vari tipi di sonde che generano un segnale sfruttando la FRET o il "quenching” in dipendenza dalla presenza del filamento a loro complementare.

Sonde Taqman, sonde di idrolisi, processo della nucleari 5’

TaqMan

Le sonde Taqman sono oligonucleotidi a singolo filamento con un fluoroforo ed uno "quencher” nella distanza di 3 a 30 basi che possono legarsi all’interno di un amplicone. Nel corso dell’amplificazione la sonda viene distrutta mediante idrolisi dall’attività nucleasica specifica per il doppio filamento associata alla Taq polimerasi. Questo risulta in un aumento del segnale fluorescente dovuto all’abolizione dell’effetto di "quenching" che dipende dalla vicinanza.

Le sonde Taqman sono relativamente sensibili per singoli "mismatch". Ciò diventa rilevante ad esempio per campioni virologici nei quali può verificarsi una tale variabilità genetica che il segnale non viene generato nonostante avvenuta amplificazione. Questa sensibilità tuttavia non si può sfruttare per la genotipizzazione in quanto l’assenza di segnale dovrebbe essere associata ad un genotipo.

Ibridazione in vicinanza

Adjacent Hybridization

Esistono varie possibilità di far ibridare due oligonucleotidi uno a fianco all’altro o di fronte all’altro. (i) Il metodo probabilmente più efficiente è il legame di due sonde marcate con un unico fluoroforo ad un templato, il formato della sonda di ibridazione (HybProbe) del Lightycler. La misurazione avviene in questo caso sfruttando la fluorescenza del fluoroforo accettante che viene eccitata attraverso un processo di FRET. Il vantaggio rispetto alle sonde di idrolisi è certamente il loro carattere modulare e, per quanto riguarda la PCR quantitativa, la loro relativa insensibilità per "mismatch" singoli ed in particolar modo il loro eccellente utilità per la genotipizzazione. Lo svantaggio consiste eventualmente nella più lunga sequenza che deve essere coperta da due sonde avvicinate.

Adjacent Hybridization

Al posto di due sonde di ibridazione può anche essere utilizzato un primer marcato che viene rivelato mediante una sonda sull’altro filamento e comunque vicino.

In modo simile si è cercato di seguire l’amplificazione mediante lo spostamento di una sonda complementare al primer. Tuttavia, anche in questo caso non si può escludere una reazione aspecifica.

Adjacent Hybridization

Per il monitoraggio della PCR sono stati usati anche coppie di oligonucleotidi complementari provviste di un fluoroforo ed un "quencher”. Le sonde si legano in equilibrio al prodotto di PCR e danno così un segnale di fluorescenza.

Molecular Beacons

Molecular Beacons

Una variante interessante delle sonde di ibridazione sono i "molecular beaons", sviluppati da Fred R. Kramer. Queste sonde portano alle loro estremità delle sequenze auto-complemenmtari ed una coppia fluoroforo/quencher in modo tale da essere presenti in una struttura ripiegata tipo "stem-loop". Questa struttura viene "sciolta" solo in presenza di una sequenza complementare fornendo quindi un segnale fluorescente. Anche i "molecular beacons sono molto sensibili per "mismatch".

Sunrise:

Una variante interessante delle sonde di ibridazione sono i "molecular beaons", sviluppati da Fred R. Kramer. Queste sonde portano alle loro estremità delle sequenze auto-complemenmtari ed una coppia fluoroforo/quencher in modo tale da essere presenti in una struttura ripiegata tipo "stem-loop" . Questa struttura viene "sciolta" solo in presenza di una sequenza complementare fornendo quindi un segnale fluorescente. Anche i "molecular beacons sono molto sensibili per "mismatch".

Genotipizzazione

La genotipizzazione analizza i polimorfismi. Ne sono esempio la determinazione della paternità, della specie, della presenza di fattori a rischio genetici e di alleli che determinano deternminate malattie. La presenza di polimorfismi può essere rivelata con sonde Taqman e "molecular beacons" solo usando sonde diverse che comprendano tutte le varianti. Se provviste di fluorofori diversi possono essere impiegate anche nello stesso saggio di reazione. Al contrario le sonde di ibridazione hanno il vantaggio che la presenza di una mutazione può essere determinata usando una sola sonda mediante una curva di dissociazione che rivela la diminuzione della temperatura di dissociazione. In caso di omozigosi si ottiene una temperatura di dissociazione unica, alta o bassa, e in caso di eterozigoti si osservano due temperature di transizione.

Previsione

I nuovi metodi di PCR a tempo reale permettono un’analisi molto più rapida di campioni nonché l’analisi qualitativa di acidi nucleici, la loro quantificazione e la genotipizzazione. Il tempo richiesto dalle analisi si riduce a 20-30 minuti in modo tale che possono essere applicati alla valutazione in emergenza. Data l’eliminazione di molti passaggi lavorativi molte analisi possono essere eseguiti a costi ridotti, fatto che dovrebbe determinare l’ulteriore diffusione del metodo della PCR nella diagnostica.

Sonde coniugate con apteni

Hapten modified Probes

Sonde coniugate con apteri vengono frequentemente impiegate per il rivelamento mediante ibridazione di acidi nucleici immobilizzati su membrane in vitro e in sito. Il metodo si basa sull’interazione di molecole con un’alta affinità per apteni, come ad esempio la streptavidina, e su anticorpi che a loro volta sono coniugati ad enzimi (per ossidasi, fosfatasi). Nell’incubazione finale si aggiunge il substrato dell’enzima che viene trasformato in un prodotto rivelabile/misurabile. In molti casi questo metodo offre una valida alternativa per all’uso di sonde radiomarcate.

Sonde a fluorescenza.

La TIB offre un’ampia gamma di fluorofori che coprono lo spettro da vicino all’UV all’infrarosso. L’impiego delle sonde marcate con fluorofori va dal sequenziamento automatico, ad analisi di microsatelliti fino all’ibridazione in situ. Sono comprese nel prezzo sequenze fino ad un massimo di 30 basi, tutte le modificazioni e la purificazione con HPLC o FPLC. I prodotti vengono desalati, liofilizzati ed inviati accompagnati da una descrizione dettagliata del prodotto.

Nota:
Taqman è un marchio registrato dalla Hoffmann-La Roche, SYBR Green è un marchio della Molecular Probes, LightCycler® è un marchio della Idaho Techologies Inc. PCR e il processo della 5’ nucleari sono coperti da brevetti della Hoffmann-La Roche. Molecular Beacons sono coperti di brevetti della PHRI, il principio "sunrise" è coperto da brevetto della Onkor. TIB MOLBIOL dispone delle licenze per la produzione di HybProbes per il LightCycler®, per la produzione di Molecular Probes e per la marcatura con un’ampia gamma di fluorofori.

Un’ampia letteratura ed esempi di applicazioni possono essere ottenute dall’autore.