La quantificazione

La quantificazione – le sonde competono con il primer esteso e il re-annealing dei singoli filamenti di DNA

Per generare un segnale le sonde di ibridazione devono legarsi ad un filamento singolo della sequenza bersaglio che è presente nella PCR solo durante la denaturazione termica e brevemente dopo. Durante la fase di raffreddamento i primer competono con le sonde – non competono per la stessa posizione, ma se un primer si è legato viene esteso immediatamente in modo tale da coprire la sequenza bersaglio. Questo processo è inoltre irreversibile: un primer esteso forma un legame più stabile e no si staccherà più nello stesso ciclo mentre le sonde si legano in modo reversibile. Dato che le sonde si devono legare anch’esse al singolo filamento di DNA la competizione avviene addirittura tra un primer e due sonde. Per questo motivo le sonde devono legarsi significativamente meglio alla sequenza bersaglio ossia devono avere una temperatura di dissociazione sensibilmente più alta dei primer.

Limiti della quantificazione

  • Il limite di sensibilità nella PCR su DNA è di 2-10 copie (genoma). Il limite dipende dalla scelta dei primer e dal bersaglio e solo in misura minima dalla scelta delle sonde
  • Il limite di sensibilità per una RT-PCR è 10-50 copie (genomi), se la reazione di RT viene eseguita separatamente e 10-20 volte più alto per le RT-PCR a passaggio singolo.
  • Il limite di sensibilità viene spesso peggiorato in seguito a perdita di campione durante l’estrazione o a diluizione durante la preparazione (molti kit di estrazione producono volumi di 100-200 ml di soluzione)
  • Il potere della PCR di rivelare il raddoppio di una quantità di bersagli è limitato (corrispondente ad un ciclo) ed è quindi non adatto a rivelare cambiamenti limitati di trascrizione o eventi come la trisomia
  • Per campioni contenenti quantità molto limitate si può lavorare con acidi nucleici "carrier" (fino a 1 mg/20 ml, per esempio DNA di sperma di arringa, DNA di placenta, RNA di lievito)
  • I "carrier" sono raccomandabili per standard clonati (plasmidi)
  • In sistemi di PCR duplex l’amplificazione del gene bersaglio meno concentrato può essere inibito da quello più concentrato. Per questo motivo non si dovrebbero usare gene ”housekeeping” fortemente espressi.
  • Due varianti non possono essere quantificati in modo differenziale usando la stessa sonda

La temperatura di dissociazione corrisponde alla forza del legame

La competizione tra le sonde e i primer, ossia del primer con lo stesso orientamento delle sonde, significa che quest’ultime dovrebbero avere una temperatura di dissociazione più alta: Consigliamo una differenza di 5-10°C on i seguenti limiti:

(1) La temperatura di dissociazione delle sonde non deve essere troppo alta affinché le sonde possano essere spostate dal filamento in via di sintesi. Se questo non è possibile l’amplificazione viene ostacolata e la PCR fallisce. Possiamo indicare come valore indicativo 5°C al di sopra della temperatura di estensione. Lo stesso si applica anche a tutte le altre sonde presenti in una reazione di PCR come le sonde TaqMan o i Molecular Beacons.

(2) La temperatura di dissociazione deve essere superiore alla temperatura di "annealing" per permettere l’effettivo legame delle sonde. Nel caso di primer particolarmente corti o deboli la temperatura di dissociazione della sonda può di conseguenza essere superiore a quella dei primer di più di 10°C.
In alternativa si possono "adattare" i primer per creare le condizioni sopraccitate. Se si modifica un primer al suo termine 5’ in genere non cambia la sua specificità. Così non si deve rivalutare tutto il sistema. Se non si conoscono altre basi al termine 5’ si possono aggiungere basi qualsiasi in modo tale che il primer troverà la sequenza bersaglio allungata dopo un primo ciclo.

La posizione di sonde di ibridazione.

In linea di massima le sonde di ibridazione possono legarsi in qualsiasi posto sulla sequenza bersaglio. Tenendo conto della competizione con i primer e con il filamento in via di sintesi si preferirà posizionare i primer il più lontano possibile dai primer. Questo significa "tutto a destra" sul filamento superiore o "tutto a sinistra" nel caso si usi una sequenza del filamento inferiore. Le sonde si legano naturalmente anche ad altre sequenze molto simili. Questo fatto è facilmente visibile per le sequenze ripetitive dove le sonde possono legarsi spostati di un elemento ripetitivo. La conseguenza del legame ad altri siti non determina un segnale erroneo. Si riduce però la concentrazione "libera" con una conseguente riduzione del segnale fluorescente. Quest’effetto è importante solo per i cicli avanzati quando si è amplificatoa abbastanza sequenza bersaglio. Al contrario del disegno dei primer nel disegno delle sonde non si deve tenere conto di siti complementari al di fuori della regione amplificata.

Consiglio per le sonde per la quantificazione

Il segnale fluorescente è proporzionale alla quantità di bersaglio. Le sonde devono legarsi bene per ottenere un buon segnale fluorescente. Le sonde competono con i primer sullo stesso filamento e di conseguenza devono essere disegnate per formare un legame più forte dei primer. Nei cicli avanzati anche la ri-ibridazione dei singoli filamenti compete e diminuisce il segnale fluorescente (effetto Hook).

Le sonde dovrebbero trovarsi lontano dal primer sullo stesso filamento.

Il primer esteso nello stesso orientamento coprirà in modo irreversibile la sequenza bersaglio delle sonde. Una distanza superiore aumenta la durata del periodo in cui il bersaglio è libero.

La temperatura di dissociazione delle sonde dovrebbe essere superiore di 5-10°C a quella dei primer, in particolare del primer che si trova nello stesso orientamento.

Le due sonde competono con un solo primer per il legame. Di conseguenza devono legarsi più strettamente.

The Tm of the probes should be higher than the annealing temperature.

The signal has to be obtained during the annealing step.

The Tm of the probes should not be much higher than the extension temperature.

This may cause the probes to block primer extension.

Nella selezione di una sonda per un dato frammento di PCR si incomincia preferibilmente "tutto in fondo" sul filamento superiore e "all’inizio" sul filamento inferiore. In caso di incompatibilità con i primer quest’ultimi possono essere spostati di alcune basi. Per sistemi nuovi si può iniziare con la scelta delle sonde e selezionare i primer compatibili successivamente. Si consiglia scegliere due o tre primer per ogni direzione per poterli valutare in tutte le combinazioni sperimentalmente. Nonostante la selezione con l’aiuto del computer l’efficienza di amplificazione e la tendenza di formare dimeri variano considerevolmente.

Considerazioni strutturali del disegno di sonde

Particolarità strutturali possono influenzare il comportamento di legame di acidi nucleici. In genere raccomandiamo di usare sequenze "bilanciate” ossia sonde con una distribuzione equa delle quattro basi. Tratti di sequenza con un legame eccezionalmente forte vanno evitati. Qui si tratta di sequenze ricche di GC dei quali è sufficiente una regione minima per formare il legame stabile e di conseguenza si troveranno anche altri siti di legame aspecifici. Sequenze ripetute e monotone non costituiscono un sito di legame discreto e porterebbero alla distribuzione delle sonde a posizioni varie.

Esempio: Tipizzazione del HSV, Espy et al. Clin. Chem. (2000)

Si usano sonde con 5 G successive che portano ad un’ibridazione "sporca".

Sequenze complementari, ad esempio palindromi estesi, possono portare alla dimerizzazione della sonda con conseguenze sulla disponibilità della sonda. Se le due sonde sono complementari una all’altra genereranno un segnale indipendentemente dalla presenza della sequenza bersaglio. Più importanti ancora sono sequenze complementari che portano all’ibridazione all’interno di una sonda, i cosiddetti "stem-loops". Per la formazione di simili strutture sono sufficienti sequenze relativamente corti. La probabilità di legame è incrementata dal fatto che le regioni complementari non si possono allontanare dando luogo a temperature di dissociazione elevate. Tutti i processi che determinano legami erronei diminuiscono la disponibilità delle sonde e di conseguenza il grado di copertura della sequenza bersaglio. Ne consegue un segnale fluorescente inferiore. In caso di necessità si possono compensare tali effetti con un’aumentata concentrazione delle sonde.

Una regola importante impone di evitare le complementarietà tra il termine 3’ dei primer e le sonde. Sequenze anche corte possono formare dimeri tra primer e sonda, in modo particolare all’inizio della reazione quando non è ancora stato amplificato nessun frammento. Questo porta a prodotti aspecifici che possono in certi casi anche generare dei segnali fluorescenti.s

Le regole generali

Le sonde di ibridazione per il LightCycler® si legano in adiacenza in modo tale che i fluorofori terminali si affacciano. Il trasferimento di energia FRET avviene solo se entrambe le sonde sono legate.

Si usano sequenze adiacenti sullo stesso filamento con uno spazio di 1-5 basi.

Il FRET dipende dalla distanza. Donatore ed accettare devono essere ravvicinati (sensibilmente al di sotto di 50 Å ossia di 15 basi).

I termini 3’ devono essere bloccati, in genere con un 3’-fosfato e come 3’-fluoresceina.

Le sonde non devono essere in grado di servire da primer.

I termini adiacenti delle due sonde devono essere marcati, preferibilmente 3’ con fluoresceina e 5' con LightCycler® Red 640/705.

Nell’orientamento inverso (5'-FAM / 3'-LC) il trasferimento FRET può fallire. La marcatura con LightCycler® Red in 3’ è possibile solo a determinate condizioni. Per la fluoresceina occorre usare derivati
della FITC per ottenere una compensazione cromatica precisa.

Le sonde devono essere "bilanciate".

Vedi di seguito.

Evitare sequenze monotone.

Le sondo potrebbero legarsi in varie posizioni.

Evitare sequenze ripetute.

Le sondo potrebbero legarsi in varie posizioni.

Evitare sequenze particolarmente ricche in GC.

Sequenze corte sono sufficienti per un legame stabile.

Evitare sequenze estremamente ricche di purine, in particoalre ricche di G.

Le sonde si legano insufficientemente.

Evitare palindromi lunghi ed in particolare "stem loops".

Palindromi lunghi (>6) e ricche di GC determinano la dimerizzazione delle sonde: "Stem loops" causano un ripiegamento. Entrambi processi diminuiscono la quantità di sonda libera, fatto compensabile solo in parte da un aumento della quantità.

Evitare sonde reciprocamente complementari.

Dimeri di sonde creano un segnale indipendente dal bersaglio.

I termini 3’ di primer non devono essere complementari alle sequenze delle sonde.

All’inizio della PCR esiste poco bersaglio ma tantissima sonda in modo tale da permettere ai primer di legarsi alle sonde e di estenderle (dimeri)..

Evitare sonde con una temperatura di dissociazione troppo alta (Tm < 80°C) che inibirebbero la PCR.

Sonde che formano un legame troppo forte non possono essere spostate dalla polimerasi a 72°C ed inibiscono l’estensione.