Introduzione

Introduzione – Trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza (FRET)

Sonde di ibridazione sono formate da una coppia di oligonucleotidi che possono ibridare in vicinanza. Esse portano ai termini, rivolti verso il partner, due fluorofori che possono interagire mediante trasferimento di energia a risonanza di fluorescenza (FRET). Il fluoroforo ad onde più corte, la fluoresceina che viene eccitata da luce blu, trasferisce la sua energia senza generare raggi al fluoroforo ad onde più lunghe, il LightCycler® Red. Quest’ultimo emette luce rossa che viene rivelata. Il segnale si genera solo nel caso in cui le due sonde si legano in vicinanza. Se le sonde sono presenti in eccesso il segnale fluorescente è proporzionale alla quantità di sequenza bersaglio presente.

Le basi dell’ibridazione

Due filamenti di acidi nucleici si legano tra di loro se le loro sequenze sono complementari. L’efficienza dell’ibridazione dipende dalla sequenza stessa. La conoscenza delle basi molecolari facilita la selezione di sonde di ibridazione adatte.

Il processo di ibridazione dipende dalla sequenza bersaglio e dalla sonda. Per una migliore comprensione consideriamo la situazione in soluzione: due sequenze complementari non si attraggono a distanza bensì collidono casualmente. Se ci sono presenti delle regioni di sequenze complementari possono legarsi. Questo si applica in ugual misura a sequenze che sono solo "simili". In caso di complementarietà di basi affiancate si legheranno anch’essi partendo da un punto di "cristallizzazione", così come si chiude una cerniera a lampo.

Il legame è reversibile. La forza del legame si calcola nei valori della termodinamica e può essere considerato come probabilità che si formi il legame. In un approccio cinetico si considerano i rapporti "on" e "off". In pratica si usa il punto di dissociazione Tm come valore misurabile. Il Tm descrive la temperatura alla quale la sequenza legata e quella libera sono in equilibrio tra di loro. Il Tm può essere determinato sperimentalmente mediante la curva di dissociazione.

Per ottenere un alto rapporto di legame si usano un eccesso di sonde di ibridazione.

La scelta delle sonde di ibridazione

Qui di seguito si spiegheranno alcune regole per la selezione. Queste regole differiscono leggermente tra le due applicazioni, quantificazione e tipizzazione.

Per la quantificazione è importante generare un segnale forte. Le sonde possono essere collocate nel luogo ideale per l’ibridazione da qualsiasi parte nella sequenza bersaglio. Nel caso della tipizzazione le sonde devono essere posizionate al sito indicato e non è possibile di evitare sequenze meno adatte, più "difficili".

Alcuni problemi non possono essere affrontati da un’analisi che impieghi sonde di ibridazione:

  • Determinazione del numero di (numerosi) elementi ripetuti di sequenza.
  • L’analisi di variazioni all’interno di sequenze ripetute.
  • La quantificazione differenziale in una PCR duplex in cui sono presenti quantità di sequenze bersaglio estremamente diversi.
  • La quantificazione differenziale usando primer identici e sonde specifiche.