Tipizzazione

Tipizzazione con sonde di ibridazione – il principio

Le sonde di ibridazione sviluppano il loro vero potenziale nella tipizzazione delle variazioni di sequenza. Può trattarsi di sostituzioni di singole basi, di delezioni o inserzioni come di altre varianti come ad esempio sequenze imparentate o varianti di "splicing".

Il principio delle sonde di ibridazione è molto semplice –la sonda "sensore" copre la sequenza variabile e la sonda "di ancoraggio" vicina forma un legame sensibilmente più forte in modo tale che l’analisi dei punti di dissociazione considera solo la sonda "sensore". I prodotti ibridati vengono lentamente riscaldati misurando la fluorescenza in continuazione. Ogni variazione di sequenza nella regione della sonda "sensore" determina un abbassamento della temperatura di dissociazione. Un campione omozigote dà un punto di dissociazione unico, un campione eterozigote ne dà due e un campione omozigote per la mutazione dà un punto di dissociazione unico ad una temperatura inferiore. La sostituzione di una singola base determina una differenza di temperatura di dissociazione di 2-10°C, a secondo il tipo di sostituzione e la sequenza vicina alla base sostituita.

Si possono determinare le varianti tuttavia solo se sono presenti in quantità paragonabili. Questo è il caso delle analisi genetiche (alleliche). Nelle analisi di contaminanti odi varianti rari, ad esempio nella diagnostica oncologica (minimal residual disease) o ancora nell’analisi di popolazioni miste questa tecnica trova dei limiti. In questi casi bisogna impiegare primer specifici per l’allele o per il tipo di sequenza per amplificare e quantificare le varianti sotto-rappresentati in modo specifico. L’integrazione dell’area delle curve di dissociazione può essere utilizzato per la determinazione quantitativa solo in modo molto limitato dato che le sonde hanno frequentemente affinità diverse per le varie sequenze bersaglio. Nei sistemi messi bene a punto l’area è tuttavia sufficiente per discriminare rapporti da 1:1 a 2:3 come occorre nel caso della determinazione della trisomia.

La tipizzazione con sonde di ibridazione – Il posizionamento

La sonda "sensore" copre la sequenza bersaglio in modo che la variazione di sequenza si trovi all’incirca a metà e comunque non meno di quattro o cinque basi dall’estremità; metà può essere inteso in considerazione della forza di legame, un termine ricco di GC potrebbe quindi essere molto più corto.

Esistono in linea di massima molte possibilità di posizionamento, con la sonda di ancoraggio a destra o a sinistra o rispettivamente sul filamento opposto a destra o sinistra. E’ difficile evitare sequenze poco adatte, in particolare palindromi e sequenze che possono formare "stem loops" se si trovano in vicinanza del bersaglio. Una variazione da determinare potrebbe trovarsi all’interno di una regione con un forte legame. Programmi dedicati che calcolano la stabilità di legame locale possono aiutare a ottimizzare le sonde; motivi di particolare forza di legame possono essere "attenuati" mediante l’uso di analoghi di basi con ridotta stabilità di legame o addirittura mediante l’incorporazione di basi "erronee". Per questo scopo si usano basi pirimidinici alogenati in 5’ e, al posto della guanosina si usa preferenzialmente l’inosina meno specifica e di legame più debole.
In generale occorre tenere conto del fatto che il mis-accoppiamento G-T è ben tollerato perché le due basi possono formare un ponte di idrogeno. La riduzione del Tm ammonta in questo caso solo a 1-4°C. Al posto di una sonda sensore con G o T si dovrebbe usare o la sonda mutata o la sonda per il filamento opposto in modo da ottenere un mis-accoppiamento A-C.

La tipizzazione con sonde di ibridazione – La specificità

Le elezioni e le inserzioni danno differenze di Tm inferiori delle mutazioni di sostituzione. Il rivelamento di mutazioni in sequenze monotone, come ad esempio il polimorfismo 4G/5G nel gene PAI-1 (Nauck et al., 1999) o quello 35Gdel nel gene connexin-26 con cinque o sei basi di guanosina, è molto difficile.
Altre mutazioni oltre a quella nota che si trovano nella zona coperta dalla sonda porteranno ad un profilo di temperatura variato: Citiamo l’esempio della variante HFE Ser65Asp che è stata inizialmente identificata attraverso la temperatura "sbagliata" (Bollhalder et. Al. Clin. Chem. 2000). In linea di principio altre mutazioni, eventualmente anche mutazioni mai descritte potrebbero evocare un effetto identico e portare così ad una diagnosi erronea. Se si usa per sicurezza l’analisi con la sonda specifica per la mutazione potrebbe verificarsi il caso della doppia mutazione che viene scambiata per il "wildtype". Per la diagnostica clinica si potrebbe quindi preferire di usare le due sonde in modo simultaneo. Questo può essere eseguito in modo molto elegante impiegando due fluorofori che possono essere letti nei canali F2 e F3 contemporaneamente.

Esempi per bersagli critici

Nell’esone 10 del gene umano CTFR esiste una delezione (Phe508del), una variante 508Ser nonché in vicinanza altre delezioni e anche un polimorfimo patologicamente irrilevante. Una sonda "wildtype" non sarà facilmente in grado di distinguere tra tutti questi varianti.

Esistono diverse varianti dei codoni 12 e 13 del gene umano k-ras che possono tutte essere rivelate con una sonda specifica per il "wildtype". Al contrario una sonda specifica per una mutazione sarà difficilmente in grado di distinguere il "wildtype” dalle altre varianti.

Entrambe le sonde, sia quella marcata con 3’-fluoresceina sia quella marcata con %’-LightCycler® Red possono essere impiegate come sonda "sensore". La prima ha il vantaggio che le sonde FI sono di produzione più rapida ed economica. Sonde FI verranno quindi usati per ottimizzare un saggio o come sonde specifiche per i vari pazienti, come nel caso dei riarrangiamenti nella diagnostica della leucemia (esempio: Eckert et. al., Leucemia, 2000). Se la sonda sensore porta il fluoroforo del LightCycler® si possono usare simultaneamente sondo specifiche marcate con i due fluorofori diversi per il "wildtype" e per la mutazione.

In fine bisogna ricordare che alcune sostituzioni di basi possono avere una grande influenza sull’amplificazione di un allele e che le varie varianti legano in modo differenziale le sonde, ad esempio per la formazione di strutture secondarie stabili, in modo tale che una variante non è rivelabile o rivelabile solo in modo poco efficiente. Inoltre, mutazioni o delezioni nelle sequenze scelte per i primer, in particolare se in sequenze introniche meno conservate, possono impedire l’amplificazione di un allele portando alla falsa iinterpretazione di omozigosi (esempio: la mutazione dell’introne 4 del gene HFE, Jeffrey et al., Nature Genetics 1999). A nostro avviso occorre validare saggi nuovi su campioni sequenziati o tipizzati e non si dovrebbero disegnare saggi per mutazioni pubblicate per identificare le stesse mutazioni senza validazione.

Consigli per le sonde per tipizzazione

La curva di dissociazione viene misurata dopo la PCR. La competizione tra primer e sonde è quindi meno rilevante. Le sonde e i primer possono essere nel caso estremo anche parzialmente sovrapposte. Le temperature di dissociazione delle sonde non devono necessariamente essere più alte di quelle dei primer.

I punti di dissociazione sono in genere più alti di quelli dei primer.

Se il punto di dissociazione è più basso di quello dei primer non si osserverà nessun segnale durante la PCR.

La posizione non è molto rilevante

Le sondo sono di solito lontane dai primer ma possono essere anche più vicine.

La sona di ancoraggio deve avere un Tm sensibilmente più alto (4-8°C) della sonda sensore.

La curva di dissociazione deve evidenziare esclusivamente il legame della sonda sensore.

La variazione di sequenza (mutazione) in esame sta all’incirca a metà della sonda sensore, comunque non oltre 4 basi dal termine.

Un mis-accoppiamento determina una riduzione di cooperazione di legame di due siti. I siti terminali "respirano" comunque, un mis-accoppiamento in questi siti determina solo una riduzione
limitata del Tm.

Evitare "mismatch" G-T. Usare invece una sonda specifica per la mutazione oppure una sonda sul filamento opposto con mis- accoppiamento A-C.

"mismatch" G-T sono ben tollerati e determinano una riduzione del Tm di solo 2-4°C rispetto ai 5-10°C degli altri "mismatch".

Motivi di sequenza con un’alta forza di legame dovrebbero essere evitati o, se inevitabili, attenuati mediante incorporazione di analoghi o basi "erronee".

Motivi di sequenza con un’alta forza di legame possono offuscare l’effetto di un mis-accoppiamento.

Evitare i "stem-loops".

Se le sonde contengono "stem loops" esiste una struttura ripiegata oltre alle forme libere e legate. La forma ripiegata potrebbe essere più stabile del legame con la variante. Come risultato le varianti potrebbero essere legate con forze diverse e la più debole potrebbe non essere rivelata.

I primer non dovrebbero essere
posizionati in regioni variabili.

Mutazioni nelle sequenze relative ai primer possono limitare l’efficienza dei primer eventualmente impedendo l’amplificazione di un allele.

Mutazioni ignote.

Variazioni di sequenza diverse da quella studiata possono evocare lo stesso effetto. Per quesiti importanti occorre usare sonde per la variante e il "wildtype" simultaneamente.

Validazione di un saggio nuovo

Si consiglia di partire per il disegno di saggi nuovi da sistemi di PCR già messi a punto oppure, nel caso di sistemi completamente nuovi, di ottimizzare la parte di PCR separatamente controllando i risultati in un gel di agarosio in modo "classico”. Se si lavora con un nuovo sistema immediatamente nel LightCycler® non si ha la possibilità di trovare gli errori in caso di non-funzionamento che potrebbe essere dovuto al bersaglio stesso, ai primer, alle condizioni di PCR, alle sonde o anche all’apparecchio. Il formato aspecifico del SYBR-Green è altrettanto limitato dato che i dimeri di primer e il prodotto non sono distinguibili in assenza di un riferimento. Il LightCycler®, come del resto le altre apparecchiature da "real time" presenti sul mercato, non è più sensibile di una PCR convenzionale; se non si vede nessun prodotto nel gel anche nel LightCycler® non sarà osservabile nessun segnale.

  • Utilizzare primer già testati. Se i primer sono nuovi o ignoti controllare il prodotto ottenuto su gel di agarosio.
  • Utilizzare in modo comparativo una serie di primer in ogni direzione per saggi nuovi.
  • Controllare il disegno e il fluoroforo/canale di sonde nuove.
  • Usare quantità "intermedie" di DNA come bersaglio per saggi nuovi. Non creare condizioni eccezionali né usare troppo materiale. Il limite massimo per una reazione di 20 ml è di 1 mg DNA (106 genomi umani, 6 pg/genoma diploide).
  • Non congelare sonde e primer liofillizzati, conservarli al buio a temperatura ambiente.
  • Sciogliere primer e sonde in acqua distillata o meglio in tampone (tampone TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0), conservare per periodi estesi a für–20°C, evitare ripetuti decongelamenti, aliquotare.