PCR En Tiempo Real

LightCycler®™

Roche Molecular Diagnostics comercializa el LightCycler®, el termociclador con monitorización del on-line del PCR basado en la detección de fluorescencia mas rápido. El sistema funciona con aire frío y caliente que proporciona rampas rápidas - pueden realizarse 30 ciclos en 20 minutos. El proceso de PCR se monitoriza mediante la cuantificación de la fluorescencia de los fluoroforos que se unen al DNA para detección general de DNA de doble cadena , o, con sondas de hibridación, para monitorizar la cantidad de una secuencia "blanco" específica. algunas de la ventajas del PCR on-line son la cuantificación directa de los amplificados y riesgo mínimo de contaminación del los productos de PCR, al evitar la manipulación post-PCR.

Canales de Detección

Las sondas estan irradiadas con un diodo que emite luz azul (470nm), que excita los fluoroforos amarillos incluiyendo la fluoresceina (FAM, FITC) y SybrGreen. La luz fluorescente emitida es detectada en tres canales: luz verde (530 nm, fluoresceina), luz roja (640 nm, LightCycler® Red 640) y cerca del infrarojo (710 nm, LC Red 700).

Formatos Experimentales:

Fluoroforos de Unión al DNA

HybProbes

Sondas de Hidrolisis

Molecular Beacons

El SYBR Green se une al DNA de doble cadena formado durante el PCR aumentando su fluorescencia

HybProbes hibridan en el producto de PCR y emiten una señal fluorescente (FRET)

Las sondas de hidrolisis contienen dos fluoroforos. El fluoroforo "quencher" es separado por hidrolisis durante la amplificación del PCR (Formato TaqMan)

Los Molecular beacons expuestos durante la unión del producto de PCR, se separan del "quencher", aumentando así la fluorescencia

canel 1 = 530 nm

canel 2 / 3

canel 1

canel 1

no específicos de secuencia

específicos de secuencia

específicos de secuencia

específicos de secuencia

aptos para cuantificación

aptos para cuantificación

aptos para cuantificación

aptos para cuantificación

los dimeros de primer pueden excluirse con las curvas de fusión

Aptos para detección de mutaciones con curvas de fusión

 

Aptos para detección de mutaciones

Ensayos con Sondas de Hibridación (Hybprobes)

Esta aproximación por fluorescencia específica se basa en la Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente (FRET). Durante la FRET, un fluoroforo dador, que es excitado por una fuente de luz LED, transfiere su energía a un fluoroforo aceptor solo cuando se encuentra situado en proximidad directa con el primero. El fluoroforo aceptor emite luz de larga longitud de onda, que es detectada en canales específicos. La LED no excita al fluoroforo aceptor.

HybProbes

Las sondas para el LightCycler® consisten en un par de oligonucleotidos que pueden unirse próximos en un ácido nucleico "blanco". El principio FRET de depende de la estrecha proximidad entre los fluoroforos. Cuanto mayor sea la cantidad de DNA no específico presente, menor podrá ser la energía de transferenciae. La cantidad de sonda hibridada aumenta a medida que aumenta la cantidad de producto de PCR. La señal es proporcional a la cantidad de amplificado.

Un set de HybProbes 640 consiste en un par de sondas de oligonucleotidos que pueden hibridar adyacentes en una muestra de DNA, una marcada con fluoresceina en su extremo 3´terminal (3FL) y la otra marcada en su extremo 5´con LC Red 640 (5LC). El grupo libre 3´-hidroxilo del extremo se bloquea generalmente con un fosfato para evitar su extensión por la polimerasa.

Cuantificación

Cuando se trabaja con standards externos cuyo numero de copias es conocido, el LightCycler® permite la determinación exacta de la cantidad de muestra. Cuando se trabaja con standards plasmídicos se recomienda el uso de preparaciones conteniendo dUracil para minimizar el riesgo de contaminación. Las peticiones externas de dU-standards están disponibles en GenExpress, Berlin.

Detección de Mutaciones

Además de la cuantificación de muestras, el formato de las sondas HybProbe permite también la detección de mutaciones mediante la monitorización del cambio de comportamiento que ocurre en las curvas de fusión de las sondas.

Diseño de Sondas de Hibridación (HybProbes)

Las sondas deben localizarse en la misma cadena, situadas en la mitad del amplificado o cerca de la mitad, pero sin solapar con los primers de la cadena complementaria. Se requiere una distancia de 1 a 5 bases entre ambos fluoroforos para asegurar un funcionamiento óptimo (distancia molecular de 4 a 25 Å).

Secuencia

Cuando se diseñen los primers deben evitarse las secuencias autocomplementarias, palindromicas y las repetitivas. En general, las secuencias deben estar balanceadas en cuanto al contenido de bases sin islas con alto contenido en GC.

Temperatura de Fusión

La temperatura de fusión, Tm, es la temperatura a la que la mitad de las moléculas complementarias se encuentran unidas. La Tm puede calcularse manualmente, siguiendo la regla de 2/4°C pero es mejor calcularla basándose en las propiedades termodinámicas de los pares de dinucleosidos. Existe un algoritmo para realizar dicho cálculo disponible en nuestra página web ( www.TIB-MOLBIOL.com). En general la temperatura de fusión de las sondas debe ser 5-10°C mas alta que la Tm de los primers.

Detección de Mutaciones

Es importante que la sonda que abarque la mutación tenga una Tm más baja que la otra sonda (sonda anchor).

Petición de Diseño

Bajo petición, evaluamos su sistema, le hacemos sugerencias o diseñamos experimentos con sondas de hibridación basándonos en sus primers de PCR. Trabajamos con diferentes programas para analizar la Tm, la estabilidad termodinámica, la cinética de hibridación, estructura de la secuencia, falsos primers y secuencias del Genbank.

TIB MOLBIOL ofrece la síntesis de sondas de hibridación (HybProbes) para el LightCycler®™ bajo licencia de Roche Diagnostics GmbH.

Disclaimer:
TIB MOLBIOL posee un sistema LightCycler® localizado en Berlin y está abierto a proyectos de cooperaciónan.Las sondas de hibridación (HybProbes) están disponibles en las siguientes.

Referencias:

  • Wittwer et al. BioTechniques (1997) 22, 130-138
  • Wittwer et al. BioTechniques (1997) 22, 176-181

Dirección:

Berlin, Genoa, Poznan

Código              

Productos

Cantidad
Deseada

17-0640-03

Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate

3 nmol

17-0640-06

Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate

2 x 3 nmol

17-0640-30

Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate

30 nmol

17-0640-33

Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate

10 x 3 nmol

17-0644-03

Custom Synthesis int. dT-C2-LC640, 3'-OH

3 nmol

17-0644-30

Custom Synthesis int. dT-C2-LC640, 3'-OH

30 nmol

17-2121-03

Custom Synthesis 3'-fluoresceine

3 nmol

17-2121-06

Custom Synthesis 3'-fluoresceine

2 x 3 nmol

17-2121-30

Custom Synthesis 3'-fluoresceine

30 nmol

17-2121-33

Custom Synthesis 3'-fluoresceine

10 x 3 nmol

17-2124-03

Custom Synthesis int. dT-C2-fluoresceine

3 nmol

17-2124-30

Custom Synthesis int. dT-C2-fluoresceine

30 nmol

17-2640-01

Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL

1 nmol

17-2640-03

Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL

3 nmol

17-2640-06

Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL

2 x 3 nmol

17-2640-30

Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL

30 nmol

17-2640-33

Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL

10 x 3 nmol

Disclaimer:
La síntesis de sondas de hibridación y oligonucleotidos conteniendo LC Red se realiza bajo licencia de Roche Diagnostics GmbH. Todos los productos son sólo para investigación. No usar para diagnóstico. No revender. LightCycler®™ es una marca regis Idaho Technology Inc. El logotipo de LightCycler®™ se utiliza bajo permiso de Roche Diagnostics GmbH.