Real-Time PCR

LightCycler®™

Roche Diagnostics introduce il più veloce thermal cycler con un sistema di monitoraggio in tempo reale della fluorescenza generata dal prodotto di PCR. Il sistema funziona mediante la veicolazione di aria calda e fredda e permette l'esecuzione di trenta cicli in soli 30 minuti. Il processo di amplificazione viene rilevato mediante la quantificazione della fluorescenza di coloranti che legano il DNA a doppio filamento, oppure, con sonde di ibridazione, viene misurata la quantità di una specifica sequenza. Fra i più importanti vantaggi della PCR in tempo reale vi sono la quantificazione diretta degli amplificati e, con l'eliminazione della manipolazione post PCR, un rischio trascurabile di contaminazioni.

I canali di detezione

Le sonde vengono irradiate con un diodo emittente luce blu (LED) (470 nm) che eccita i coloranti gialli contenuti nella fluoresceina (FAM, FITC) e SybrGreen. La fluorescenza emessa è rilevata mediante tre canali: uno per la luce verde (530 nm, fluoresceina), uno per la luce rossa (640 nm, LightCycler® Red 640) ed uno per il vicino infrarosso (710 nm, LC Red 700).

Formati sperimentali:

DNA-binding dyes	HybProbes	Hydrolysis Probes	Molecular Beacons
SYBR Green si lega al prodotto di PCR (doppio filamento) producendo un segnale molto intenso	Ibridizzano sul prodotto di PCR ed emettono un segnale- fluorescente (FRET)	Le sonde idrolitiche contengono due coloranti. Il quencher viene rilasciato durante la PCR (TaqMan)	Si svolgono durante la rescita del prodotto di PCR, separando il quencher ed aumentando la fluorescenza
canale 1 = 530 nm	canale 2 / 3	canale 1	canale 1
non è sequenza-specifico	sequenza specifiche	sequenza specifiche	sequenza specifiche
permette la quantificazione	permette la quantificazione	permette la quantificazione	permette la quantificazione
i primer-dimers possono essere eliminati con una curva di melting	è possibile la detezione di mutazioni con una curva di melting		è possibile la detezione di mutazioni

Analisi con sonde di ibridazione

Questo approccio sequenza specifico è basato sul trasferimento di energia di risonanza fluorescente (FRET). Durante il FRET, un fluoroforo donatore, eccitato da una luce blu LED, trasferisce la sua energia ad un fluoroforo accettore solo nel momento in cui si trova nelle sue immediate vicinanze. Il fluoroforo accettore emette luce ad una lunghezza d'onda superiore che viene rilevata in canali specifici. L'accettore non viene eccitato dalla luce LED.

Sonde di ibridazione

Le sonde per il Lightcycler sono formate da una coppia di oligonucleotidi che si legano in immediata adiacenza sulla sequenza bersaglio. Il principio FRET dipende in fatti dalla vicinanza sterica dei due fluorofori. In assenza del bersaglio non avviene il trasferimento di energia. La quantità di coppie di sonde ibridate aumenta assieme al prodotto di PCR. Il segnale è proporzionale alla quantità di amplicon accumulato.

Un set di HybProbes 640 consiste in una coppia di oligonucleotidi che possono ibridare in vicinanza su un templato di DNA. Uno degli oligonucleotidi porta la fluoresceina al termine 3’ mentre l’altra porta il fluoroforo LC Red 640 al termine 5’. Il gruppo idrossilico del 3’ è normalmente protetto mediante fosforilazione contro l’estensione da parte della polimerasi.

Quantificazione

L’impiego nel LightCycler® di standard esterni con un numero di copie noto permette la determinazione esatta della concentrazione di partenza della sequenza bersaglio, Raccomandiamo l’uso di preparazioni plasmidiche modificate con d-uracile per minimizzare il pericolo di contaminazione. Standard esterni dU sono disponibili dalla GenExpress GmbH su richiesta.

Analisi di mutazioni

Oltre alla quantificazione di una sequenza bersaglio le sonde di ibridazione permettono di identificare mutazioni della sequenza bersaglio mediante le curve di dissociazione.

Disegno delle HybProbes

Le sonde devono essere situate sullo stesso filamento, posizionate indicativamente al centro del prodotto di PCR, ma non sovrapposte ai primers sul filamento opposto. E' consigliata una distanza da una a cinque basi fra i due fluorofori per assicurare una performance ottimale (4-25 Å).

Sequenza

Sono da evitare le sequenze ripetitive, autocomplementari e palindromiche nel disegno dei primers. In generale, le sequenze dovrebbero presentare un contenuto bilanciato fra le basi con ristrette regioni ricche in G e C.

Melting Point

E' la temperatura alla quale metà delle molecole complementari sono ibridate. La temperatua di melting (Tm) può essere calcolata a mano seguendo la regola dei 2/4°C, sebbene sia comunque consigliabile l'impiego di calcoli basati sulle proprietà termodinamiche degli appaiamenti. Un algoritmo per il calcolo è disponibile alla nostra homepage ( www.TIB-MOLBIOL.com). In generale, la Tm delle sonde dovrebbe essere superiore di 5-10°C a quella dei primers.

Detezione di mutazioni

E' importante che la sonda che attraversa la mutazione abbia una Tm inferiore a quella dell'altra sonda (sonda anchor).

Disegno su richiesta

Viene controllato il vostro sistema, vi vengono forniti suggerimenti o disegnamo direttamente la vostra analisi con le HybProbes basata sui vostri primers di amplificazione dopo un controllo eseguito su diversi programmi che valutano la Tm, la stabilità termodinamica, le cinetiche di ibridazione, la struttura della sequenza, i false priming e le sequenze di Genbank.

Le Hybprobes sono disponibili nei seguenti quantitativi: 1 nmol, 3 nmol e 30 nmol. Altri formati sono disponibili su richiesta. I prezzi delle sonde includono la sintesi dei corrispondenti oligonucleotidi (al massimo 30 basi). Tutti i prodotti sono purificati mediante una procedura multistep di HPLC, desalificati e forniti liofilizzati.

Disclaimer:
TIB MOLBIOL offre il servizio di sintesi delle HybProbes per il LightCycler®TM sotto licenza di Roche Diagnostics Boehringer Mannheim GmbH. TIB MOLBIOL è lieta di cooperare in progetti di ricerca ed ha a disposizione lo strumento a Berlino.

Letteratura:

• Wittwer et al. BioTechniques (1997) 22, 130-138
• Wittwer et al. BioTechniques (1997) 22, 176-181

Adress:

Berlin, Genoa, Poznan

Codice	Descrizione	Quantità
17-0640-03	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	3 nmol
17-0640-06	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	2 x 3 nmol
17-0640-30	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	30 nmol
17-0640-33	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	10 x 3 nmol
17-0644-03	Custom Synthesis int. dT-C2-LC640, 3'-OH	3 nmol
17-0644-30	Custom Synthesis int. dT-C2-LC640, 3'-OH	30 nmol
17-2121-03	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	3 nmol
17-2121-06	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	2 x 3 nmol
17-2121-30	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	30 nmol
17-2121-33	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	10 x 3 nmol
17-2124-03	Custom Synthesis int. dT-C2-fluoresceine	3 nmol
17-2124-30	Custom Synthesis int. dT-C2-fluoresceine	30 nmol
17-2640-01	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	1 nmol
17-2640-03	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	3 nmol
17-2640-06	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	2 x 3 nmol
17-2640-30	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	30 nmol
17-2640-33	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	10 x 3 nmol

Disclaimer:
Il servizio di sintesi HybProbes e degli oligo contenenti fluorofori LC Red è sotto licenza di Roche Diagnostics Boehringer Mannheim GmbH. Tutti i prodotti sono indicati solo per ricerca e non per la diagnostica. Non è permessa la rivendita. LightCycler®™ è un marchio registrato di Idaho Technology Inc. L'uso del logo LightCycler®™ è autorizzato da Boehringer Mannheim.