Nachweis von Influenza A Viren vom Subtyp H5N1

Roche Applied Science und TIB MOLBIOL haben im November 2005 LightCycler® basierte Testsysteme für den Nachweis von Influenza H5N1 angekündigt. Roche Applied Science Avian Flu Information

Influenza A Viren

Influenza Viren messen etwa 100 nm im Durchmesser. Ihr Genom besteht aus acht einzelsträngigen RNA Sequenzen von 900 bis 2400 Basen Länge.

Vögel sind die natürlichen Wirte von Influenza A Viren. Die Viren sind bei 2-5% der Population nachweisbar, zu Zeiten des Vogelzuges bis zu 15% (Niesters, Virology Rotterdam).

Die aviären Influenza Viren werden serologisch über die Haemagglutinin (HA oder H) und Neuraminidase (NA oder N) Glycoproteine in verschieden Subtypen eingeteilt. Beide Protein sind integrale Bestandteile der Virushülle. Die Spanische Grippe wurde durch ein Virus vom Subtyp H1N1 verursacht. Beim Menschen findet man häufiger die Typen H2N2 und H3N2. Der neue agressive Typ H5N1 hat in Asien und jetzt auch in Europa etliche tödliche Infektionen bei Menschen verursacht.

RNA Viren verändern sich rapide. Für den Nachweis per PCR muß man besser konservierten Genregionen verwenden - bei Influenza A bevorzugt man das Matrix Protein Gen M2. Für den Nachweis des Subtypus müssen spezifische Fragmente in den HA und NA Genen verwendet werden.

Für den Nachweis von PCR Produkten bieten die FRET Hybridisierungssonden gewisse Vorteile, da sie Basenaustausche tolerieren und zumindest in der Schmelzanalyse ein Signal zeigen.

Das LightMix® Konzept

LightMix Kits enthalten lyophilisierte Mischungen von Primern und Sonden und einen Standard (Verdünnungsreihe 1 bis 10E5 Kopien) für jeweils 16 Reaktionen. Die Reagenzien sind für die Verwendung mit den LightCycler® Instrumenten und den Master Reagenzien von Roche Diagnostics optimiert. LightMix Kits enthalten keine Polymerase oder Nukleotide.

LightMix® Kits für den Nachweis von InfA H5N1

Für den PCR Nachweis des viralen Genomes muß die RNA in cDNA umgeschrieben werden. Die Sensitivität ist im allgemeinen besser, wenn die PCR auf cDNA durchgeführt wird. Alternativ kann der Nachweis mittels einer One-Step RT-PCR durchgeführt werden.

Best.Nr	Produkt	LightCycler®	VE
40-0219-16	LightMix H5	1.x, 2.0, 480	96 Rkt.
40-0230-16	LightMix N1	1.x, 2.0, 480	96 Rkt.
40-0234-16	LightMix M2	1.x, 2.0	96 Rkt.
40-0277-96	LightMix M2 HT	480	480 Rkt.
40-0242-16	LightMix H5N1	1.x, 2.0	96 Rkt.

Die LightMix Kits sind für die Verwendung mit dem LightCycler® Instrumenten 1.x und 2.0 entwickelt worden; die Kits für H5 und N1 können auch mit dem LightCycler® 480 verwendet werden. Für den Screening Assay auf das M2 Gen gibt es ein gesondertes Produkt für den LC480. Nähere Informationen können Sie in Form eines PDF Dokuments laden

LightMix Produkte sind für die Verwendung in der Forschung gedacht.

Nachweisstrategie - Screening auf M2 und Test auf H5 & N1

Das LightMix Produkt für den Nachweis des Matrix Protein Genes (im Kanal F2/640) enthält eine interne Kontrolle im zweiten Kanal (F3/705), um die Abwesenheit von PCR Inhibitoren in Virus-negativen Proben zu verifizieren.

Positive Proben können mit den Kits für den Nachweis des H5 und/oder des N1 Genes auf den Subtyp H5N1 hin untersucht werden.

Auswahl der Sequenzen

Die Primer und Sonden, die im LightMix H5 Verwendung finden, wurden schon im Januar 2004 auf Anfragen aus Thailand entworfen. Diese Sequenzen sind mehr als 50.000 mal in Asien verwendet worden und können daher als gründlich getestet gelten. Das amplifizierte Fragment ist in dem im Juni 2005 von der WHO empfohlenen PCR Produkt enthalten. Nach den Ergebnissen einer BLAST Analyse gab es für die verwendeten Forward Primer 337 bzw. 375 vollkommen übereinstimmernde Virussequenzen in der Genbank - gegenüber nur 179 für die WHO Primer. Die reversen Primer hatten vergleichbare Werte.

Die Primer für den Nachweis des N1 Genes wurden auf der Grundlage von Alignments von N1 Sequenzen ausgewählt. Auch für diese Primer war die Anzahl der identischen Sequenzen in der Genbank signifikant höher (357 und 258) als die der von der WHO empfohlenen Primer (114 und 124).

Die Sonden im LightMix M2 basieren auf unseren Entwürfen, 2003 publiziert von Smith et al. Die Primer sind an die Arbeit von Schweiger et al, 2000 angelehnt, aber auf den Nachweis der aktuellen Typen H5N1 optimiert.

Sensitivität

Die LightMix Komponenten wurden unter Verwendung von cDNA Proben aus Asien entwickelt. Im LightCycler® wird eine Sensitivität von 10 Genomäquivalenten erreicht (Plasmid).

Spezifität und Validierung

Das Deutsche Referenzlabor für humane Influenza (Robert-Koch-Institut, Berlin) hat den LightCycler® Tests für H5 und N1 schon im Herbst 2005 eine befriedigende Sensitivität attestiert. Das Referenzlabor für die aviäre Influenza (Friedrich-Löffler-Institut, Insel Riems) hat Anfang 2006 ein Panel von über 80 Isolaten getestet und bestätigt, daß die aktuellen H5N1 Viren mit den LightMix Produkten H5, N1 und M2 nachweisbar sind.

Nachweis der Tamiflu Resistenz (Neuraminidase H274Y)

Die Mutation Histidin 274 nach Tyrosin verleiht dem H5N1 Virus Resistenz gegen den Neuraminidase-Hemmer Oseltamivir (Tamiflu). Diese Mutation läßt sich mittels einer Schmelzanalyse mit Hybridisierungssonden nachweisen. Wir haben diesen Assay mit einem Kompetitor ausgestattet, so daß 1:1.000 im Wildtyp verdünnte resistente Viren noch nachweisbar sind (siehe Artikel in Forschung_Diagnostik_01/2006)

Best.Nr.	Produkt	LightCycler®	VE
40-0243-16	InfA Tamiflu	1.x, 2.0	96 Rkt.

Literatur

Recommended laboratory tests to identify avian influenza A virus in specimens from humans, WHO Geneva, 06-2005

Rapid detection of influenza A and B viruses in clinical specimens by Light Cycler real time RT-PCR. Smith AB, Mock V, Melear R, Colarusso P, Willis DE. J Clin Virol. 2003 Sep 28(1):51-58

Application of a fluorogenic PCR assay for typing and subtyping of influenza viruses in respiratory samples. Schweiger B, Zadow I, Heckler R, Timm H, Pauli G. JCM 38 (2000) 1552-1558

Roche Influenza H5N1 Information : www.roche-applied-science.com/sis/avian

Nachweis derTamiflu-Resistenz bei Influenza H5N1, Olfert Landt, Forschung_Diagnostik_01/2006

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These reagents were developed and manufactured by TIB MOLBIOL®, Berlin, Germany. LightCycler® hybridization probes produced under license from Roche Diagnostics. LightCycler® is a registered trademark of a member of the Roche group. For Reseach Use Only.