Real-Time PCR

LightCycler® Instrumente

Roche Diagnostics hat 1998 das erste kapillarbasierte LightCycler® Gerät auf den Markt gebracht, die schnellsten Thermocycler mit online Fluoreszenz-Detektion. Die extrem hohen Heiz- und Kühlraten ermöglichen die Durchführung von 30 Zyklen in 20 Minuten. Die Quantifikation erfolgt durch Fluoreszenz-Messungen von DNA bindenden Farbstoffen bei der generellen Detektion von doppelt strängiger DNA oder mit Hybridisierungssonden bei der spezifischen Quantifizierung einer Zielsequenz. Die Hauptvorteile der online PCR Detektion sind die direkte Quantifizierung und die Herabsetzung der "carry-over" contamination mit PCR Produkten durch das wegfallen der Post-PCR Manipulationen.

Detektionskanäle

Die Fluorophore werden mit einer Blau-Licht emittierenden Diode (470 nm) beleuchtet. Gelb-grüne Fluorophore wie Fluorescein und SybrGreen werden angeregt und die resultierende Emmissionsfluoreszens kann im Kanal 1 gemessen werden. Das angeregte Fluorescein kann über Fluoreszens Resonanz Energie Transfer (FRET) benachbarte Fluorophore wie das LC Red 640 oder LC Red 705 anregen, deren Emissionsfluoreszens im zweiten (F2, 640 nm) oder respektive dritten (F3, 705 nm) Kanal gemessen.

Experimental formats:

DNA bindende Farbstoffe	Hybridisierungs Sonden	Hydrolyse Sonden	Molecular Beacon Sonden
SybrGreen bindet an doppeltsträngige DNA wodurch die Fluoreszens von SybrGreen stark zunimmt	Hybridisierungs Sonden binden an ihre komplementäre Sequenz innerhalb des PCR Produkts wodurch eine Emmissions- fluoreszens entsteht (FRET)	Hydrolyse Sonden besitzen einen Reporterfarbstoff und einen Quencher Farbstoff. Bei der Amplifikation wird die Fluoreszensunterdrückung des Reporter Farbstoffes aufgehoben. (TaqMan Format)	Molecular Beacon, ebenfalls ausgerüstet mit Quencher und Reporter, falten sich bei der Bindung an die Zielsequenz auf. Die Fluoreszensunterdrückung wird dabei aufgehoben.
Kanel 1 = 530 nm	Kanälel 2 / 3	Kanal 1	Kanall 1
Sequenz unspezifisch	Sequenz -spezifisch	Sequenz - spezifisch	Sequenz - spezifisch
Quantifizierung möglich	Quantifizierung möglich	Quantifizierung möglich	Quantifizierung möglich
Primer-dimere können mit der Schmelkurvenanalyse dargestellt werden	Mit der Schmelzkurvenoption ist eine Mutationsanalyse möglich		Mutationsdetektion möglich

Hybridisierungssonden Ansatz

Der sequenzspezifische Detektionsansatz mittels Hybridisierungssonden basiert auf Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET). Ein Donor-Fluorophor, welches mit der LED Lichtquelle angeregt wird, überträgt seine Energie auf ein Akzeptor Fluorophor, wenn dieses sich in unmittelbarer Nähe befindet. Der Akzeptor Farbstoff emittiert Licht mit einer längeren Wellenlänge. Die Lichtquelle kann den Akzeptor-Farbstoff nicht direkt anregen.

FRET Hybridisierungssonden

LightCycler® Sonden bestehen aus einem Paar Sonden, die benachbart auf der Zielsequenz binden. Das FRET-Prinzip ist abhängig von der räumlichen Nähe beider Farbstoffe. In Abwesenheit des Targets kann der Energietransfer nicht stattfinden. Die Menge hybridisierter Sondenpaare steigt mit der Menge des PCR Produktes. Das Signal ist proportional zur Menge des akkumulierten Amplikons.

Ein Satz Hybridisierungssonden besteht aus einem Paar Oligonukleotiden, die benachbart auf einem DNA Templat binden können, wobei die eine Sonde ein Fluorescein am 3’ Ende trägt während die Partner Sonde am 5’Ende mit einem LC Red 640 Farbstoff modifiziert ist. Die freie 3’ Hydroxylgruppe ist durch eine Phosphat Modifikation gegen eine Verlängerung durch die Polymerase blockiert.

Quantifikation

Die Verwendung externer Standards mit einer bekannten Menge ermöglicht die exakte Bestimmung der Ausgangskonzentration der Zielsequenz. Wir empfehlen die Verwendung von dUracil modifizierten Plasmidpräparationen, um die Kontaminationsgefahr zu minimieren. Externe dU Standards sind im Kundenauftrag von GenExpress GmbH erhältlich.

Mutationsanalyse

Neben der Quantifikation einer Zielsequenz können mit dem Hybridisierungs Proben Format Mutationen des Targets über die Schmelzkurvenanalyse des LightCycler®s identifiziert werden.

Sonden Design

Die Sonden sollten auf dem gleichen Strang und in der Mitte des Amplikons oder nahe dem Primer des Gegenstranges liegen.

Sequenz

Selbstkomplemetäre, palindromische und repetitive Sequenzen sollten vermieden werden. Die Sequenzen sollten eine ausgewogene Basenzusammensetzung aufweisen und keine GC-reichen Regionen haben.

Schmelzpunkt

Der Schmelzpunkt, Tm, ist die Temperatur bei der die Hälfte der komplementären Sequenzen gebunden vorliegen. Der Tm kann nach der 2/4ºC Faustregel berechnet werden. Bessere Ergebnisse ergibt die Berechnung auf der Grundlage der thermodynamischen Eigenschaften der Dinucleosid Paare. Ein derartiger Algorithmus für die Berechnung des Tm können sie auf unserer Homepage im OligoShop finden. Im Allgemeinen sollte der Schmelzpunkt der Sonden 5 bis 10ºC über dem der Primer liegen.

Mutationsdetektion

Es ist wichtig, dass die Sensor-Sonde, die über der Mutation liegt, einen wesentlich niedrigeren Schmelzpunkt als die Anker-Sonde haben.

Design im Kundenauftrag

Auf Anfrage bewerten wir gerne Ihren Entwurf, machen Vorschläge oder entwerfen Sonden für Ihre etablierten PCR Primer. Wir verwenden verschiedene Programme, um den Schmlezpunkt Tm, die thermodynamische Stabilität, Hybridisierungskinetiken, Sequenzstrukturen und etwaige falsche Bindungsstellen zu analysieren.

Hybridisierungssonden sind in folgenden Stoffmengen erhältlich: 1 nmol, 3 nmol, 6 nmol und 30 nmol. Andere Mengen, auch grössere, auf Anfrage. Der Preis versteht sich inklusive der Synthese des entsprechenden Oligonukleotids (max. 30 Basen). Alle Produkte werden einer multiplen HPLC-Reinigung unterworfen und entsalzt. Die Lieferung erfolgt lyophilisiert.Literatur:

• Wittwer et al. BioTechniques (1997) 22, 130-138
• Wittwer et al. BioTechniques (1997) 22, 176-181

Adress:

Berlin, Genoa, Poznan

Code	Produkt	Liefermenge
17-0640-03	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	3 nmol
17-0640-06	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	2 x 3 nmol
17-0640-30	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	30 nmol
17-0640-33	Custom Synthesis 5'-LC640, 3'-phosphate	10 x 3 nmol
17-0644-03	Custom Synthesis int. dT-C2-LC640, 3'-OH	3 nmol
17-0644-30	Custom Synthesis int. dT-C2-LC640, 3'-OH	30 nmol
17-2121-03	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	3 nmol
17-2121-06	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	2 x 3 nmol
17-2121-30	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	30 nmol
17-2121-33	Custom Synthesis 3'-fluoresceine	10 x 3 nmol
17-2124-03	Custom Synthesis int. dT-C2-fluoresceine	3 nmol
17-2124-30	Custom Synthesis int. dT-C2-fluoresceine	30 nmol
17-2640-01	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	1 nmol
17-2640-03	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	3 nmol
17-2640-06	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	2 x 3 nmol
17-2640-30	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	30 nmol
17-2640-33	Custom Synthesis HybProbe 640 Set 5LC /3FL	10 x 3 nmol

Disclaimer:
Custom synthesis of HybProbes and oligonucleotides containing LC Red dyes under license of Roche Diagnostics GmbH. All products are for research only. Not for use in diagnostics. No resale. LightCycler® is a trademark of Roche. The use of the LightCycler® logo with permission of Roche Diagnostics GmbH.